Les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central, autrement appelées microglies, présentent de nombreux prolongements particulièrement dynamiques. Diverses études ont suggéré qu'au-delà d'un possible rôle dans la surveillance, cette dynamique pourrait permettre d’établir une communication physique avec les cellules avoisinantes, dont les neurones. Ce dynamisme cellulaire pourrait être donc en lien avec des mécanismes synaptiques, sous le contrôle de l'activité neuronale. Cependant, les voies de signalisation modulant le contrôle neuronal de la motilité microgliale restent largement inconnues.
Parmi les nombreuses voies de communication entre la microglie et les neurones, nous nous sommes intéressés à la signalisation impliquant une chimiokine neuronale, la fractalkine, et son récepteur microglial, Cx3cr1. L’intérêt de cette voie de signalisation, en plus d’une communication directe et spécifique entre ces deux types cellulaires, est son impact sur la chimiotaxie ainsi que sur la plasticité synaptique.
Ainsi, afin d’étudier l’impact de l’activité neuronale sur les cellules microgliales et leur possible implication dans des mécanismes de plasticité, nous avons décidé d’étudier la morphodynamique microgliale au cours des cycles veille-sommeil. Cette approche nous permet ainsi d’avoir des modulations non pathologiques d’activité neuronale, mais également d’étudier la possible fonction des cellules microgliales dans un contexte connu pour moduler la plasticité synaptique, à savoir le sommeil. Par la suite, nous avons étudié les conséquences de l’invalidation du récepteur Cx3cr1 microglial sur ces régulations morphodynamiques pour évaluer l’implication de la voie de la fractalkine.
Les changements morphodynamiques ont été évalués par imagerie transcrânienne in vivo en utilisant la microscopie biphotonique, tandis que l'électroencéphalogramme et l'électromyogramme ont été enregistrés pour définir les états de vigilance. Nous avons ensuite évalué l'impact des cycles veille-sommeil et de l’invalidation des récepteurs de la fractalkine pour comprendre leur rôle dans la dynamique microgliale.
Nos résultats indiquent une diminution de la morphodynamique microgliale pendant le sommeil lent en début de phase inactive. Nous avons également constaté que la déplétion du récepteur à la fractalkine abolit ces changements morphodynamiques, indiquant que la fractalkine pourrait être impliquée dans la détection et/ou la réponse de la microglie aux changements d'activité neuronale.
En conclusion, ce travail identifie la fractalkine comme un potentiel modulateur de la dynamique microgliale en réponse aux changements d’activité neuronale au cours du sommeil.

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central. Elles contribuent largement aux processus neuroinflammatoires, mais leur fonction exacte dans le cerveau adulte sain demeure mal connue. En conditions non pathologique, la microglie se caractérise par des prolongements hautement ramifiés et dynamiques, patrouillant constamment le parenchyme. Il a été montré récemment que les microglies contactaient les éléments neuronaux, parmi lesquels les synapses. Cependant, le but précis des contacts microglie-synapse ainsi que les mécanismes régissant ces contacts restent à déterminer.
Certaines études suggèrent que la microglie pourrait contribuer à la plasticité synaptique, et des données récentes indiquent que des variations d’activité neuronale et d’états de vigilance sont corrélées à des changements de morphodynamique microgliale. L’adénosine, un métabolite de l’ATP, apparaît comme potentiel médiateur dans la relation entre les neurones et les microglies. En effet, l’adénosine est une molécule clé dans la régulation du sommeil et les récepteurs à l’adénosine, exprimés par les microglies, pourraient être impliqués dans le chimiotactisme microglial. La présente étude vise premièrement à mieux caractériser le lien entre activité synaptique et dynamique microgliale. Le second objectif est de déterminer si les voies de signalisation de l’adénosine sont impliquées dans la communication microglie-neurone.
Pour ce faire, de l’imagerie in vivo a été réalisée sur un modèle de souris transgénique pour suivre à la fois la morphodynamique microgliale et l’activité calcique des épines dendritiques. La stimulation de vibrisse (SV) a été utilisée pour manipuler l’activité neuronale de façon physiologique tout en imageant dans la couche dendritique L2-3 du cortex en tonneaux. L’administration IP d’agoniste et antagoniste des récepteurs à l’adénosine a été réalisée pour évaluer la contribution de la voie de l’adénosine dans cette communication.
Nos résultats indiquent que l’augmentation d’activité synaptique induite par la SV entraine un rapprochement des prolongements microgliaux vers les épines, une augmentation de la probabilité de contact ainsi que des durées de contact plus longues en moyenne. Inversement, la diminution d’activité synaptique induite par la SV provoque un éloignement des prolongements microgliaux, une diminution des contacts et de leur durée. En outre, nous avons remarqué que l’administration systémique de caféine et de CGS-21680 avait un impact sur l’activité neuronale. En portant notre attention sur la dynamique microgliale vis-à-vis des épines dendritiques, nous avons montré que les deux composés bloquaient le couplage dépendant de l’activité entre la microglie et les neurones. De façon plus intéressante, nous avons observé une diminution des contacts microgliaux en présence de l’agoniste des A2AR CGS-2680. Ces résultats indiquent que l’adénosine pourrait constituer une molécule de signalisation importante contribuant aux interactions entre la microglie et les neurones.
Dans son ensemble, ce travail montre que la proximité des prolongements microgliaux avec les épines est directement contrôlée par les changements d’activité synaptique. Dans cette communication bidirectionnelle, la voie de signalisation de l’adénosine semble jouer un rôle majeur. Des études plus approfondies restent cependant nécessaires pour mieux comprendre le rôle de l’adénosine dans cette communication, et de façon plus générale pour identifier la fonction de ce neuromodulateur et de la microglie dans l’homéostasie synaptique.

La protéine LGI1 est une protéine neuronale sécrétée, exprimée dans le système nerveux central, principalement au niveau de l’hippocampe. Des perturbations de la fonction de la protéine LGI1 ont été identifiées dans deux pathologies caractérisées par des crises d’épilepsie : une forme héréditaire d’épilepsie du lobe temporal autosomique dominante (ADLTE) provoquée par des mutations dans le gène LGI1, et des encéphalites limbiques (EL) auto-immunes caractérisées par des troubles neurologiques dus à la présence d’auto-anticorps anti-LGI1 dans le sérum et/ou dans le liquide céphalo-rachidien des patients. Afin de comprendre comment l’altération de la protéine LGI1 génère des crises d’épilepsie, des études se sont intéressées à la fonction de la protéine LGI1 dans la régulation du réseau neuronal. Ces études ont mis en évidence que la protéine LGI1 joue un rôle primordial au niveau des synapses excitatrices, en formant un complexe trans-synaptique avec ses partenaires transmembranaires ADAM22 et ADAM23. Par la formation de ce complexe, la protéine LGI1 régule l’expression des récepteurs AMPA (R-AMPA) qui sont impliqués dans la transmission synaptique. De manière surprenante, il a été montré que la perturbation de la protéine LGI1 réduit l’expression des R-AMPA à la surface des synapses excitatrices. Cependant, ce résultat est en contradiction avec l’apparition des crises d’épilepsie qui sont générées en raison d’une hyperexcitabilité du réseau neuronal. Ainsi, l’objectif de mon projet de thèse a été de comprendre comment une réduction de l’expression des R-AMPA conduit au déclenchement de crises d’épilepsie lorsque la protéine LGI1 est altérée. Pour expliquer cela, nous avons émis l’hypothèse que la réduction de l’expression des R-AMPA affecterait principalement les synapses excitatrices présentes sur les neurones inhibiteurs. La réduction de l’activité inhibitrice résultante favoriserait l’hyperexcitabilité du réseau neuronal. Pour tester cela, nous avons analysé les effets d’un blocage de la protéine LGI1 par des anticorps (ac) anti-LGI1 provenant du sérum de patients atteints d’EL. Grace à un modèle de souris infusée avec les ac anti-LGI1, nous observons, par une étude réalisée en microscopie super-résolution STORM, que la perturbation de la protéine LGI1 réduit l’expression des R-AMPA à la surface des neurones excitateurs et inhibiteurs dans le gyrus denté de l’hippocampe. Par électrophysiologie, nous avons enregistré les potentiels de champs locaux dans la région CA1 dans des tranches aigues d’hippocampe de souris infusées avec les ac anti-LGI1. Nous montrons que le blocage de la protéine LGI1 augmente l’hyperexcitabilité du réseau neuronal. De plus, nous observons, par pharmacologie, que les ac anti-LGI1 perturbent l’activité du réseau inhibiteur qui ne parvient plus à contrôler l’excitabilité neuronale. L’ensemble de nos résultats indique que la diminution de l’expression des R-AMPA dans le gyrus denté de l’hippocampe, par les ac anti-LGI1, réduit plus drastiquement l’activité du réseau inhibiteur. Ainsi, mes résultats suggèrent que la perturbation du réseau inhibiteur dans le gyrus denté serait un mécanisme impliqué dans la génération des crises d’épilepsie chez les patients atteints d’EL à ac anti-LGI1.

Skeletal muscles are formed of multinucleated fibers. Muscle fusion is a crucial process that starts during embryogenesis and continues throughout lifetime during growth and repair. Fusion is tightly regulated in time and space. In fact, over-fusion leads to aberrant muscle masses whereas defect in fusion induces abnormal formation and/or repair of the muscles. The fusion process has been studied for years and many genes are known to be involved in this process. Most of them are required for fusion: during cell-cell recognition, adhesion, actin rearrangement or for transcriptional regulation. This field of research is still in expansion, recently new crucial pro-fusion genes have been identified, such as Myomaker and Myomerger. Even if the cellular events of fusion are well understood, the cellular and molecular mechanisms regulating fusion are more obscure. The goal of my work was to understand the dynamics and molecular mechanisms underlying this process during early muscle formation, particularly to identify inhibitors of fusion. A C2C12 esiRNA screen performed in our lab identified a number of genes involved in fusion regulation. Among them, the TGF-beta superfamily was identified as inhibitor of fusion without impacting on muscle differentiation. During my thesis I used in situ hybridization and in ovo electroporation in the chicken embryo to decipher the role of TGF-beta signaling in vivo during myogenesis. I show that TGF-beta regulates the pace of fusion by acting as a molecular brake of muscle fusion in vivo during the first step of myogenesis.

L'organisation spatiale des composants de la synapse neurochimique conditionne l'efficacité du transfert d'information. En particulier, la localisation des récepteurs à proximité des sites de libération des neurotransmetteurs est un facteur déterminant de la réponse postsynaptique. Cette distribution dépend le plus souvent d'échafaudages protéiques cytoplasmiques qui ancrent les récepteurs à la synapse. Néanmoins, les protéines de la matrice extracellulaire (MEC) participent également de façon active à l'organisation de la synapse. Chez C. elegans, MADD-4 (ou Ce-punctin) est une protéine de la MEC sécrétée par les monotoneurones qui joue le rôle d'organisateur des jonctions neuromusculaires et contrôle l'identité excitatrice cholinergique ou inhibitrice GABAergique des domaines postsynaptiques. Au cours de ma thèse, j'ai montré que MADD-4 contrôle la localisation synaptique du syndécan, une protéine de la MEC appartenant à la famille des héparanes sulfate protéoglycans (HSPG). Les HSPG sont impliqués dans la migration cellulaire et axonale dans le système nerveux central des mammifères. Ils sont également présents aux synapses, mais leurs rôles sont mal caractérisés. Je me suis intéressée au rôle du syndecan dans le contrôle de la localisation des récepteurs de l'acétylcholine et du GABA aux jonctions neuromusculaires. Le syndecan (sdn-1) est une protéine transmembranaire de type I qui se compose d’un domaine extracellulaire portant des chaines de glycosaminoglycans, et d’un domaine intracellulaire dont les derniers acides aminés (EFYA) permettent la liaison aux protéines contenant un domaine PDZ. En absence de syndecan des défauts de guidage axonale ont été constatés lors de précédentes études. J’ai montré que le syndecan est enrichi aux jonctions neuromusculaires de C. elegans et se localise aux deux types de synapses. L’insertion d’une étiquette DEGRON a permis de dégrader de façon tissu-spécifique la protéine de syndecan, démontrant que sa présence à la synapse dépend majoritairement du tissu musculaire. J’ai également étudié les domaines de SDN-1 nécessaires à sa localisation synaptique. Le domaine extracellulaire s’avère nécessaire, en revanche les chaines de glycosaminoglycan ne semblent pas requises pour sa localisation à la synapse. De plus, la présence de MADD-4 apparait essentielle au recrutement de SDN-1 aux synapses. L’absence de syndecan entraine une diminution de la quantité de récepteurs aux synapses dont la plus drastique a été observée pour les récepteurs cholinergiques composés par la sous-unité ACR-16, sensibles à la nicotine. Le domaine de liaison aux domaines PDZ du syndecan est essentiel à la localisation de ces récepteurs. Cette étude positionne le syndecan comme un acteur majeur de la localisation synaptique des récepteurs cholinergiques sensibles à la nicotine, chez C. elegans. Ces résultats permettent de formuler de nouvelles hypothèses sur la fonction des syndécans dans le SNC des vertébrés.

Les canaux potassiques de deux-domaines pore (K2P) appartiennent à une grande famille de canaux ioniques impliqués dans la détermination et le maintien du potentiel de la membrane cellulaire au repos. Les canaux K2P sont des protéines largement conservées au cours de l'évolution, présents dans presque toutes les cellules animales. Chez le nématode Caenorhabditis elegans, 47 gènes codent des sous-unités de canaux K2P, mais seuls trois d'entre eux ont été caractérisés dans la littérature. Grâce à la fusion de protéines fluorescentes par CRISPR/Cas9, nous avons montré que 9 canaux sont co-exprimés dans le le body wall muscle de C. legans, montrant une localisation sous-cellulaire très spécifique. La localisation la plus intriguante est celle de TWK-28, qui a une distribution en forme de comète qui n'occupe que l'extrémité antérieure de chaque cellule musculaire. Afin d'élucider les mécanismes cellulaires qui sous-tendent cette distribution particulière, nous avons effectué un crible génétique sur la nouvelle souche mutante gain de fonction de TWK-28. Nous avons révélé que des gènes appartenant au complexe protéique associé à la dystrophine (DAPC) sont impliqués dans la détermination de la quantité de ce canal à la surface des cellules musculaires. Le DAPC est composé d'au moins 10 protéines intra et extracellulaires et joue un rôle clé dans la connexion physique de la matrice extracellulaire au cytosquelette d'actine. Lors du marquage de plusieurs composants de DAPC avec des protéines fluorescentes par CRISPR/Cas9, nous avons constaté que la plupart des protéines associées à la dystrophine, comme la syntrophine/STN-1, la dystrobrévine/DYB-1 ou même les sarcoglycanes (SGCA-1 et SGCB-1), présentent une distribution particulièrement asymétrique dans le muscle de C. elegans. Nous avons également révélé la présence, jusqu'ici exclue, de dystroglycan/DGN-1 dans le body wall muscle de C. elegans. Enfin, la distribution asymétrique de TWK-28 le long de l'axe antéro-postérieur à l'échelle cellulaire et tissulaire, suggère que les voies de polarité planaire pourraient être impliquées. Par une approche de gène-candidat de la voie WNT, nous avons montré que des protéines telles que Disheveled, ROR/CAM-1 ou le ligand WNT/EGL-20 peuvent modifier la localisation de TWK-28 en le localisant dans un nouveau sous-complexe postérieur dans les cellules musculaires.

Les auto-anticorps dirigés contre CASPR2 (Contactin-2 Associated Protein), une protéine d'adhésion neuro-gliale, ont été décrits dans au moins trois syndromes neurologiques auto-immuns: l'encéphalite limbique auto-immune, la neuromyotonie acquise et le syndrome de Morvan. Cependant, le phénotype clinique associé aux anticorps anti-CASPR2 demeure imparfaitement décrit. Ce travail de thèse vise à décire les présentations cliniques des patients avec anticorps anti-CASPR2. La première étude est consacrée à l'analyse de la présentation clinique et du pronostic de l'encéphalite limbique auto-immune à anticorps anti-CASPR2. Nous observons que la majorité des patients sont des hommes âgés de 50 à 75 ans, et ont fréquemment des symptômes extra-limbiques, en particulier une ataxie cérébelleuse. Ces patients répondent le plus souvent aux immunothérapies, bien qu'un quart des patients garde des séquelles cognitives, une épilepsie, ou une ataxie. Dans la seconde étude, nous décrivons pour la première fois l'ataxie épisodique auto-immune, un symptôme jusqu'ici exclusivement associé à l'encéphalite auto-immune avec anticorps anti-CASPR2. Ce symptôme est similaire aux ataxies épisodiques héréditaires et, de façon remarquable, nous avons décelé chez 2 patients un polymorphisme rare des gènes KCNA1 ou CACNA1A, qui sont impliqués respectivement dans l'ataxie épisodique de type 1 et de type 2. Bien que l'impact de ces variants rare sur la fonction des canaux ioniques qu'ils codent est inconnu, ces observations soulèvent la question de l'influence du terrain génétique sur la détermination du phénotype neurologique des patients avec anticorps anti-CASPR2. Dans la troisième étude, nous réalisons une analyse typologique des symptômes des patients dans le but de vérifier si les symptômes se distribuent de façon aléatoire ou au contraire forment des profils cliniques spécifiques. Par cette méthode, nous démontrons que les symptômes s'associent de façon non-aléatoire, permettant de classer les patients en trois groupes distincts, qui correspondent à l'encéphalite limbique auto-immune, à la neuromyotonie, et au syndrome de Morvan. De plus nous confirmons la grande variété de présentation clinique de l'encéphalite à anticorps anti-CASPR2, qui ne se limite pas à la présence de symptômes limbiques, puisque plus d'un tiers de patients présente également des symptômes extra-limbiques, tels que l'ataxie cérébelleuse, la dysautonomie, la perte de poids, ou des mouvements anormaux. De façon notable, moins de dix pour cent des patients avaient une combinaison de symptômes limbiques et de neuromyotonie. Enfin, le syndrome de Morvan se caractérise dans notre série par des signes sévères d'hyperexcitabilité nerveuse périphérique, des signes sévères de dysautonomie, une insomnie sévère, une perte poids fréquente, et une association au thymome malin. Cette classification clinique en trois syndromes est confortée par des variations des caractéristiques des auto-anticorps, puisque les patients avec une encéphalite limbique ont des titres sériques d'anticorps anti-CASPR2 plus élevés, et des anticorps anti-CASPR2 détectable plus souvent dans le liquide céphalo-rachidien, ainsi que par des différences en terme d'haplotype HLA associé, puisque les patients avec un syndrome de Morvan ne sont pas porteurs de l'haplotype HLA DRB1*1101 qui est retrouvé chez les patients avec une encéphalite limbique à anticorps anti-CASPR2. En conclusion, ce travail de thèse conforte la notion que les patients avec anticorps anti-CASPR2 présentent des syndromes spécifiques, l'encéphalite limbique, la neuromyotonie acquise, et le syndrome de Morvan. La variabilité clinique observée avec les anticorps anti-CASPR2 est vraisemblablement liée à l'existence de mécanismes physiopathologiques différents selon les syndromes.

Les récepteurs du guidage axonal sont souvent capables de lier plusieurs ligands, qui eux-mêmes agissent via différents récepteurs, ce qui complexifie la compréhension des impacts fonctionnels en aval de chaque couple ligand-récepteur. Au cours de la navigation des axones commissuraux à travers la ligne médiane de la moelle épinière dans la plaque du plancher (PP), PlexinA1 (PlxnA1) agit en tant que récepteur pour deux signaux de guidage, Sema3B quand il est complexé à Neuropilin2 (Nrp2) et SlitC indépendamment de Np2. SlitN, produit avec SlitC à la suite du clivage de Slit complet, se lie à d’autres récepteurs, les Roundabouts (Robo1/2). Pour déterminer les contributions spécifiques de la signalisation PlxnA1/SlitC dans la navigation de la PP, nous avons généré une lignée de souris qui possèdent la mutation Y1815F sur PlxnA1. Précédemment, il a été montré in vitro que cette mutation abroge la réponse à SlitC mais pas à Sema3B. Nous avons trouvé que cette mutation récapitule spécifiquement l’un des phénotypes des embryons PlxnA1-/-. Cette contribution n’est pas le résultat d’une distribution spatiale spécifique de SlitC dans la PP. En effet, en se servant de rapporteurs fluorescents variés, nous avons trouvé que le patron de SlitC ressemble étroitement à celui de SlitN, ce qui suggère que la contribution de SlitC provient de son récepteur. Pour approfondir, nous avons exploré la nature du processus nécessitant le résidu Y1815. En imageant PlxnA1 fusionné à la pHluo dans divers paradigmes ex vivo et en analysant les données de spectrométrie de masse, nous avons observé que Y1815 altère la dynamique de surface de PlxnA1 et son réseau d’interactions, révélant que c’est un paramètre crucial pour la fonction de SlitC. Plus généralement, notre étude fournit la première dissection de la contribution spécifique d’un couple ligand-récepteur de guidage au cours de la navigation des axones commissuraux.

La navigation des axones sur de longues distances est jalonnée de zones de choix, entraînant des changements de direction pour suivre des trajectoires hautement stéréotypées. Dans ce modèle de guidage séquentiel, chaque étape est vue comme essentielle à la suivante. De façon intrigante, quelques exemples suggèrent que le suivi strict de la trajectoire puisse être dispensable pour que les axones atteignent leur destination finale. Nous nous sommes intéressés à cette capacité trajectoire indépendante des axones à localiser leur cible. Pour ce faire, nous avons utilisé deux populations neuronales de la moelle épinière ayant des cibles diamétralement opposées dans l'organisme : les interneurones dorsaux, qui projettent dans le système nerveux central, et les motoneurones ventraux, qui ciblent les muscles en périphérie. Après avoir été déplacés chirurgicalement dans des embryons de poulet, ces deux populations de neurones envoient des axones vers leurs territoires cibles qu'ils atteignent par des trajectoires inédites. Ces observations suggèrent l'existence d'un système de guidage global délivrant aux axones des informations spatiales à large échelle. Outre les signaux moléculaires de guidage bien connus, les signaux bioélectriques sont également des candidats intéressants pour remplir cette fonction. Des champs électriques (CE) ont été détectés dans les embryons en développement et sont connus pour être des vecteurs d'information spatiale. Nous avons testé sur des neurones en culture si des CE comparables à ceux mesurés pendant le développement embryonnaire pourraient guider l'élongation des axones moteurs et d'interneurones dorsaux de poulet. Nous avons trouvé que les deux types d'axones s'orientent en direction de la cathode (-) dans un CE. Cependant, ils présentent des sensibilités significativement différentes aux CE, qui pourraient contribuer à des choix de trajectoires différents in vivo. Ensuite, nous avons observé un effet inhibiteur de la Concanavaline A (ConA) sur la réponse des axones aux champs, indiquant un rôle des récepteurs membranaires connus pour lier la ConA. Nous avons donc réalisé un screen pharmacologique sur des pompes et des canaux ioniques qui se lient à la ConA, conduisant à l'identification des pompes Na+/K+ ATPases comme des candidats prometteurs. Des expériences préliminaires d'invalidation des sous-unités de ces pompes suggèrent qu'elles contribuent à la réponse aux CE et à la navigation axonale in vitro et in vivo. Finalement, nos résultats apportent une vision nouvelle des mécanismes assurant la fidélité et la résilience du guidage axonal, et révèlent la contribution méconnue des signaux bioélectriques et des pompes Na+/K+ ATPases au développement neuronal.

During embryonic development, commissural axons are guided through the midline, crossing from one side of the CNS to the other one at specific time points and positions to project onto contralateral neurons. Several sources of attractive cues regulate their navigation. In addition, repulsive forces act at different steps to keep the axons along their path. In the developing spinal cord, commissural axons cross the midline in a ventral territory, the floor plate (FP). Commissural axons gain sensitivity to repellents present in the FP after their crossing. The setting of these novel properties is necessary for preventing the axons to cross back and also for pushing them towards FP exit. Various ligand/receptor couples have been reported to mediate these repulsive forces. Whether commissural axons gain response to all the repulsive cues at the same time is not known. Whether these repulsive cascades have specific functions is suggested by different outcome of their invalidation in mouse models, but how are set these differences also remains unknown. We hypothesized that the generation of functional specificities could be achieved though specific controls of the spatial and temporal dynamics of guidance receptors at the growth cone surface. During my PhD, I developed a set up for time-lapse imaging of “open book” spinal cords, to monitor the dynamics of guidance receptors in axons experiencing native guidance decisions across the midline. To visualize their cell surface sorting, receptors were fused to the pH-sensitive GFP, pHLuorin, whose fluorescence at neutral pH reports membrane protein pools (Nawabi et al, 2010; Delloye-Bourgeois et al, 2014), and were expressed in spinal commissural neurons through in ovo electroporation. This paradigm revealed striking differences in the temporal dynamics of Nrp2, Robo1, Robo2 and PlexinA1, the receptors known to mediate the responsiveness to the major midline repellents referenced in vertebrates: Slit-Ns, Slit-Cs and Semaphorin3B. Moreover, using super-resolution microscopy, I could evidence that PlexinA1 and Robo1 are sorted in distinct subdomains of commissural growth cones navigating the floor plate. I also introduced the pHLuo-tagged receptors in the mouse embryo. These experiments showed that the temporal sequences established in the chick are conserved in the mouse, and that FP crossing in Robo1/2 mutant embryos was rescued in growth cones that could achieve cell surface sorting of Robo1. Thus, my results show that guidance receptors for midline repellents have highly specific spatial and temporal dynamics. The generation of a temporal sequences of cell surface sorting thus represents a mechanism whereby commissural growth cones discriminate concomitant signals by functionalizing them at different timing of their spinal cord navigation.

Les canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) sont des régulateurs principaux de l’excitabilité cellulaire car ils jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien du potentiel de repos des cellules animales. Malgré leur rôle fondamental, peu d’informations sont connues sur les processus cellulaires qui contrôlent la fonction des canaux K2P in vivo. En particulier, nous ne connaissons que quelques facteurs qui contrôlent directement le nombre, l’activité et la localisation des K2P à la surface des cellules.Durant ma thèse, j’ai utilisé des stratégies d’ingénierie du génome que j’ai associé à des approches génétiques afin de caractériser le canal potassique EGL-23. Pour cela, j’ai réalisé un crible suppresseur du phénotype de défaut de ponte du mutant egl-23(n601) et un crible visuel sur le rapporteur fluorescent traductionnel egl-23::TagRFP-T. Grâce au reséquençagecomplet du génome, j’ai pu cloner 4 gènes impliqués dans la régulation du canal EGL-23.

Les canaux potassiques à deux domaines P (K2P) contrôlent l’excitabilité cellulaire et jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien du potentiel de repos membranaire dans la majorité des cellules animales. Depuis leur identification dans les années 90, ces canaux ont été impliqués dans de nombreuses fonctions comme la modulation de l’activité neuronale, l’activité du muscle cardiaque ou encore la physiologie rénale. Malgré l’importance de ces canaux, peu de données existent sur les processus cellulaires qui contrôlent leur fonction in vivo. Au cours de ma thèse, j’ai utilisé des approches génétiques, d’imagerie et d’électrophysiologie pour comprendre comment l’expression, la distribution et l’activité du canal K2P UNC-58 sont contrôlés chez le nématode modèle C. elegans.Pour cela, j’ai effectué un crible suppresseur du phénotype locomoteur du mutant gain de fonction unc-58(e665). J’ai ainsi obtenu 133 mutants présentant une large gamme de niveaux de suppression, suggérant l’implication de plusieurs gènes dans les processus de régulation du canal. En utilisant les technologies de reséquençage complet de génome, j’ai pu cloner six nouveaux gènes requis pour la fonction d’unc 58.J’ai ensuite caractérisé en détail le rôle d’unc-44/ankyrine dans le contrôle du trafic d’unc 58. Ce travail a conduit à 4 conclusions majeures : (1) UNC-58, malgré sa structure de canal potassique, possède en réalité une sélectivité ionique altérée favorisant le passage des ions sodium, (2) l’addition à UNC 58 de protéine fluorescente par approche CRISPR/Cas9 nous a permis pour la première fois d’observer directement la distribution du canal UNC-58 in vivo, (3) l’ankyrine est nécessaire à l’adressage du canal UNC-58 à la surface des muscles et dans les axones des neurones mécanosenseurs ALM. Cette fonction fait intervenir une poche d’interaction lipidique localisée au sein du module Zu5N-Zu5C-UPA d’UNC-44, (4) ce mécanisme est hautement sélectif puisqu’il n’est pas requis pour l’adressage de 6 autres canaux potassiques musculaires. Mon crible a également identifié une interaction génétique entre unc-70/ß-spectrine et unc-44/ankyrine. Toutefois, la nature moléculaire de cette interaction reste encore à préciser.

Au cours du développement du système nerveux, l'activité des cibles post-synaptiques permet le raffinement du nombre et de la force des connexions neuronales. En employant la jonction neuromusculaire de Caenorhabditis elegans comme système modèle, nous avons étudié deux aspects de la mise en place de ces connexions. D'une part, nous montrons que le nombre de récepteurs présents à la jonction neuromusculaire est contrôlé par l'activité musculaire : une augmentation de l'activation synaptique entraîne une régulation différentielle des trois types de récepteurs présents à la jonction neuromusculaire. D'autre part, nous avons étudié les changements de la morphologie de certains motoneurones de la tête du ver, appelés neurones SAB, en fonction de l’activité musculaire. Une diminution de l’activité musculaire durant une période critique du développement entraîne une surcroissance axonale des neurones SAB. À travers différentes approches, nous avons pu identifier la suppression de la surcroissance axonale dans des mutants où la biosynthèse des neuropeptides est perturbée. Enfin, nous avons mis en évidence que la surcroissance axonale apparait également lors de perturbations plus générales de la physiologie cellulaire, telles qu'un choc thermique ou la surexpression d'un transgène, ce qui suggère que le système SAB est plastique et particulièrement sensible au cours du développement.

La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est un processus incontournable dans de nombreux contextes normaux et pathologiques, tels que gastrulation, organogenèse, fibroses et cancers. Cette transformation de cellule épithéliale en cellule mésenchymateuse est indissociable de l’acquisition de propriétés migratoires et est généralement associée à un changement de destin cellulaire. Différentes voies moléculaires sont impliquées selon le contexte de l’EMT concernée. Récemment, notre laboratoire a mis en évidence que la voie Notch cytoplasmique contrôle l’EMT des cellules de la lèvre dorso-médiale du somite (DML). Les crêtes neurales exprimant DLL1 activent « en passant » le récepteur NOTCH, liberant ainsi le domaine intra-cytoplasmique de NOTCH (NICD). Dans le cytoplasme, NICD inhibe la kinase GSK3ß, conduisant à la stabilisation de SNAIL, un gène maître de la transition épithélio-mésenchymateuse. Il en résulte une libération de la βcaténine des jonctions adhérentes qui, après translocation dans le noyau, active la transcription des gènes de la myogénèse (Myf5). Ainsi, l’activation de la voie Notch cytoplasmique permet une induction concomitante de l’EMT et de la myogénèse. La fonction cytoplasmique de Notch reste controversée et le mécanisme par lequel NICD inhibe GSK3ß reste obscur.
Au cours de ma thèse j’ai cherché à élucider le mécanisme par lequel NICD inhibe l’activité kinase de GSK3ß. J’ai confirmé l’interaction de GSK3ß et de NICD en démontrant leur interaction via CoIP. Après avoir démontré l’implication de la sérine-thréonie kinase AKT dans la myogenèse des cellules de la DML, j’ai mis en évidence, via CoIP et électroporation, que l’inhibition GSK3ß par NICD est très certainement médiée par AKT, connue pour être impliquée dans l’EMT et inhiber GSK3ß par phosphorylation. En comparant le NICD1 de poulet et les 4 NICD de souris, j’ai montré que l’expression exogène de ces 5 molécules induit l’EMT et la différenciation myogénique de manière similaire. J’ai aussi montré que parmi des différents domaines de NICD, le domaine RAM, connu pour se lier à l’ADN (via RBPJ), est nécessaire et suffisant à l’inhibition de GSK3ß.
Un second axe de ma thèse a été de tester l’implication de la voie Notch cytoplasmique dans d’autres contextes d’EMT. Pour ce faire, j’ai mis en évidence que cette voie est impliquée dans les autres lèvres du dermomyotome mais aussi dans les crêtes neurales qui délaminent du toit du tube neural. J’ai en particulier mis en évidence une co-activation des voies Wnt et Notch, une inhibition de la kinase GSK3ß par NICD cytoplasmique ainsi qu’une inhibition de la différenciation en présence d’une ß-caténine mutée, retenue à la membrane, ou en présence d’une molécule SNAIL2 dominant-négative.
Le dernier axe de ma thèse a consisté à élucider le mécanisme de régulation de l’induction de l’EMT et de la myogenèse via l’activation de NICD. Il a été mis en évidence que toutes les cellules de la DML peuvent être activées via DLL1 et que la surexpression massive de NICD dans la DML provoque une différenciation massive et une déplétion du groupe de cellules progénitrices. Afin de déterminer si la régulation de cette initiation se fait avant ou après induction de NICD, j’ai créé un plasmide permettant de répondre à cette question et afin de visualiser son expression in vivo, j’ai initié une collaboration avec une équipe de l’ILM afin de créer un microscope vertical SPIM biphoton permettant l’observation d’embryon de poulets vivants. Ce projet est encore en cours.
Ainsi, mon travail de thèse a permis de i) préciser le mécanisme par lequel NOTCH et GSK3ß interagissent physiquement au niveau cytoplasmique lors de l’induction de l’EMT et de la myogenèse des cellules de la DML et j’ai ajouté un nouvel acteur à ce complexe, AKT qui permettrait de médier l’inhibition de GSK3ß par NICD via phosphorylation, de ii) démontrer que cette voie Notch cytoplasmique est présente dans au moins deux autres EMT embryonnaires, celles de la lèvre ventro-latérale du somite et celle des crêtes neurales, et iii) de mettre en place de nouveaux outils d’imagerie in vivo pour explorer les aspects dynamiques de ces mécanismes.

Que se passe-t-il quand le système immunitaire attaque le cerveau ? Dans l'encéphalite à autoanticorps dirigés contre les récepteurs NMDA, le système immunitaire des patients dysfonctionne : au lieu de produire des anticorps pour combattre des organismes pathogènes, le système immunitaire produit des anticorps qui attaquent une protéine spécifique dans le cerveau des patients, les récepteurs NMDA. Ces récepteur sont indispensables à la mémoire et sont impliqués dans diverses maladies (schizophrénie, maladie d'Alzheimer). Les patients atteints d'encéphalite à autoanticorps dirigés contre les récepteurs NMDA souffrent de troubles neuropsychiatriques sévères (hallucinations, paranoïa, mouvements anormaux, épilepsie, amnésie, etc.) et la gravité de leur état de santé nécessite une prise en charge en réanimation. Malgré cette sévérité, 8 patients sur 10 récupèrent avec un traitement adapté. Les patients souffrant de cette maladie sont majoritairement des jeunes femmes porteuses d'une tumeur des ovaires. Le premier objectif de ma thèse est de comprendre le rôle de cette tumeur dans le dysfonctionnement du système immunitaire de ces patientes. Mon second objectif est de comprendre comment les autoanticorps attaquant les récepteurs NMDA vont perturber le fonctionnement du cerveau. Apporter des éléments de réponse à ces questions permettra à terme d'améliorer la prise en charge des patients.

Le neuroblastome est un cancer pédiatrique diagnostiqué chez les très jeunes enfants. afin de pouvir étudier l'impact de signalisation embryonnaire sur le développement de la maladie in vivo, nous avons mis au point un nouveau modèle d'étude du neuroblastome chez l'embryon aviaire. Ce nouveau modèle nous permet d'étudier in vivo la contribution de différentes signalisation à la tumorigénèse neuroblastique. nous avons donc mis en évidece le rôle de Sema3C et HDGF dans la tumorigénèse neuroblastique.

Les encéphalites à anticorps (Ac) anti-récepteur NMDA (NMDAR) sont des pathologies auto-immunes nouvellement décrites ciblant un récepteur majeur du système nerveux central, le NMDAR. Les synapses glutamatergiques assurent la majeure partie de la transmission excitatrice du cerveau et les récepteurs ionotropiques au glutamate de type NMDA ont un rôle clé dans la plasticité synaptique, c'est-à-dire les modifications de la force de transmission synaptique constituant le corrélat cellulaire des processus d'apprentissage et de mémoire. Les études in vitro et in vivo de l'effet des Ac anti-NMDAR tendent à montrer une altération de la dynamique des NDMAR et une internalisation. Les Ac auraient un effet pathogénique pouvant expliquer des symptômes. Au cours de ma thèse, j'ai souhaité approfondir la compréhension de cette pathologie sur le plan clinique et mécanistique. Pour cela j'ai étudié les caractéristiques cliniques et histologiques des patients présentant une tumeur maligne associée, me permettant d'établir des recommandations de prise en charge au vu du taux de mortalité plus élevé chez ces patients et d'une fréquence plus importante de tératomes ovariens immatures que dans la population générale. En parallèle j'ai étudié l'effet des Ac anti-NMDAR sur la transmission et la plasticité synaptique dans un modèle murin d'administration chronique des anticorps. Ces études menées en électrophysiologie sur tranches aigües m'ont permis de mettre en évidence un effet des anticorps du LCR sur la plasticité synaptique significatif mais d'amplitude moindre que les études in vitro l'avaient suggéré. Nous avons également montré l'importance de la durée d'exposition aux anticorps.

Les cils et les flagelles sont des organites conservés chez les eucaryotes où ils jouent des rôles essentiels et variés comme la motilité et la signalisation cellulaire. La zone de transition est une structure complexe, localisée à la base des cils, indispensable à l'assemblage du cil et pour la sélection des constituants ciliaires. Chez l'Homme, de nombreuses pathologies appelées ciliopathies sont associées à des défauts d'assemblage ou de fonctionnement des cils. Les plus sévères sont liées à des défauts de protéines de la zone de transition. La zone de transition comprend les fibres de transition qui font le lien entre le centriole et la membrane plasmique, puis les liens Y avec une composition protéique complexe organisé en 3 complexes, MKS, NPHP et CEP290 interagissant étroitement entre eux. D'autres protéines, dont CBY conservée des mammifères à la drosophile, s'ajoutent à ces modules mais leur interconnections ne sont pas connues.Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé fonctionnellement les orthologues des protéines des fibres de transition et analysé la fonction de nouvelles protéines de la zone de transition en utilisant le modèle de la drosophile. J'ai également caractérisé une protéine impliquée dans la spermatogenèse qui est essentielle pour l'individualisation des spermatides et la fertilité des males.En conclusion, ce travail apporte de nouvelles connaissances sur l'assemblage de la zone de transition et sur le rôle de CBY dans les mécanismes qui contrôlent la ciliogenèse. De plus l'étude de Salto amène à une meilleure compréhension de la spermatogenèse chez la drosophile.

Les cils et les flagelles sont des organites conservés chez les eucaryotes où ils jouent des rôles essentiels et variés comme la motilité et la signalisation cellulaire. La zone de transition (ZT) est une structure complexe, localisée à la base des cils, indispensable à leur assemblage et pour la sélection des constituants ciliaires. Chez l'Homme, de nombreuses pathologies appelées ciliopathies sont associées à des défauts d'assemblage ou de fonctionnement des cils. Les plus sévères sont liées à des défauts de protéines de la ZT. Cette dernière est composée principalement de trois complexes protéiques nommés MKS, NPHP et CEP290 interagissant étroitement entre eux. D'autres protéines, dont CBY conservée des mammifères à la drosophile, s'ajoutent à ces modules mais leur interconnections ne sont pas connues Deux modes d'assemblage ciliaire ont été décrits : la ciliogenèse compartimentée et cytosolique. La fonction de la ZT au cours de la ciliogenèse compartimentée a fait l'objet de nombreuses études mais son rôle dans la ciliogenèse cytosolique reste peu connu. Au cours de ma thèse j'ai analysé la fonction de nouvelles protéines de la ZT en utilisant le modèle de la drosophile qui présente les 2 types de ciliogenèse. J'ai d'une part réalisé un crible protéomique en cellules murine IMCD3 et caractérisé le module protéique CBY, composé de CBY, FAM92A et DZIP1L. Ce module est conservé chez la drosophile à la ZT. Il est nécessaire à la ciliogenèse notamment pour l'assemblage de la ZT et pour l'ancrage du corps basal à la membrane plasmique. L'absence de ces protéines entraine des défauts ciliaires importants dans l'assemblage des flagelles de spermatozoïde et des cils des neurones sensoriels chez les drosophiles.En conclusion, ce travail apporte de nouvelles connaissances sur l'assemblage de la ZT et sur le rôle de CBY dans les mécanismes qui contrôlent la ciliogenèse.

Au cours de la mitose, la ségrégation des chromatides, la partition du matériel cytoplasmique entre cellules filles et leur position relative se fait selon un plan qui est préfiguré par la plaque métaphasique. Ainsi, l'orientation de ce plan est un processus crucial pour le contrôle du destin des cellules, pour la morphogenèse durant l'embryogenèse et pour l'homéostasie tissulaire. Jusqu'à aujourd'hui, les mécanismes intrinsèques impliqués dans le positionnement du plan de division ont reçu beaucoup d'attention. En revanche, peu d'études ont exploré l'implication de signaux extracellulaires dans l'orientation du plan de division. Pourtant, l'axe des divisions cellulaires dont la position est souvent stéréotypée est largement associé aux axes de polarités du tissu. Au cours de ma thèse, je me suis demandé si des signaux extracellulaires capables de délivrer des informations de position spatiale aux cellules dans le cadre de leur migration, de leur différenciation morphologique, ou de leur polarisation, pouvaient influencer l'orientation des divisions cellulaires. En particulier, je me suis intéressée aux facteurs impliqués dans le guidage axonal à travers l'étude des mitoses des progéniteurs neuraux chez l'embryon de souris. Dans la moelle épinière en développement, les progéniteurs neuraux effectuent leur division au contact du canal central, lequel renferme le liquide céphalo-rachidien (LCR), une source de nombreux facteurs extracellulaires comme les morphogènes. Nous avons montré que la présence de molécules du LCR était nécessaire pour une orientation appropriée du plan de divisions des progéniteurs neuraux localisés au contact du canal central. Priver les progéniteurs neuraux de LCR par l'ouverture du tube neural ou provoquer génétiquement l'obstruction du canal central affecte les proportions de divisions planaires et obliques. Nous avons identifié la protéine Sémaphorine 3B, secrétée par les cellules de la plaque du plancher et les plexus choroïdes, comme un signal extrinsèque contrôlant l'orientation des divisions des progéniteurs neuraux dans la moelle épinière. L'invalidation génétique de Sema3B chez la souris phénocopie la perte d'accès au LCR des progéniteurs. Une application exogène de Sema3B sur des embryons dont le tube neural a été ouvert compense la déficience de LCR. Nous avons pu montrer que Sema3B se lie à ses récepteurs Neuropilines à la surface apicale des progéniteurs mitotiques et agit sur l'architecture des microtubules via l'activation de la voie GSK3/CRMP2, voie initialement mise en évidence dans le contexte du guidage axonal. Afin d'identifier de nouveaux facteurs influençant le positionnement du fuseau mitotique en réponse à ce facteur de guidage, une analyse transcriptomique des progéniteurs neuraux des mutants Sema3B-/- a été réalisée et des gènes candidats dérégulés en contexte d'invalidation de Sema3B ont été considérés. Durant la seconde partie de ma thèse, j'ai exploré l'implication du gène Norbin/Neurochondrin. De manière intéressante, le knock- down de Norbin dans les cellules HeLa altère l'orientation du fuseau mitotique. L'ensemble de ces travaux révèle donc la contribution d'une large famille de signaux topographiques jusqu'à présent inexplorée, dans l'orientation des divisions cellulaires et ouvre un large champ d'investigation passionnant concernant leur action moléculaire et cellulaire dans la neurogenèse et la morphogenèse.

La formation des neurites constitue une étape cruciale dans le processus de différenciation neuronale. Cependant, les mécanismes qui permettent de déterminer comment et à quelle position les neurites émergent sont toujours largement méconnus. Nous avons postulé qu'une marque moléculaire pouvait préfigurer la différenciation morphologique. Au cours de ma thèse, j'ai cherché à identifier de nouvelles molécules capables de s'accumuler aux sites d'initiation des neurites et d'en contrôler la protrusion. De manière intéressante, chez la levure, la marque moléculaire qui contrôle le site de protrusion du bourgeon a été caractérisée. Parmi les centaines de protéines contrôlant le site d'initiation chez la levure, les Septines constituent une famille de protéines bien conservée chez les vertébrés. Ces GTPases forment des filaments qui agissent comme barrière de diffusion ou « échafaudage » moléculaire. Au cours de ma thèse, je me suis donc intéressée au rôle des Septines lors de l'initiation axonale dans le modèle des neurones sensoriels de DRG chez l'embryon de poulet. Nous avons pu démontrer qu'aux stades précoces de leur développement, ces neurones formaient deux axones, un au pôle ventral et l'autre au pôle dorsal, indiquant que le nombre et la position des sites d'initiation des axones sont bien contrôlés dans ces neurones. Nous avons, ensuite, démontré que les Septines étaient bien exprimées dans les DRG aux stades précoces du développement. Mes analyses en vidéo-microscopie de la localisation de la septine 7 au cours de la différentiation des neurones de DRG montrent que les Septines s'accumulent au site d'émergence de l'axone, juste avant ou lors de sa formation. L'inhibition des Septines induite par une construction dominant-négative (DN) ou par ajout d'un inhibiteur pharmacologique bloque la formation des axones. De plus, cette inhibition entraine une modification précoce de la morphologie, qui se traduit par l'apparition de cellules multipolaires complexes et de cellules rondes sans prolongement suggérant que, conformément à notre hypothèse, les Septines sont impliquées dans l'initiation des neurites. L'ensemble de ces résultats montre que les Septines régulent la différenciation morphologique précoce des neurones sensoriels.

Les cils et les flagelles sont des organites présents à la surface cellulaire. Ils sont conservés chez les eucaryotes chez lesquels ils jouent un rôle essentiel dans la régulation de nombreux processus physiologiques. La zone de transition (ZT) est une structure complexe, localisée à la base des cils, qui assure une fonction importante dans l'assemblage et la régulation du trafic des constituants ciliaires. Trois complexes protéiques ont été identifiés à la ZT : MKS-JBTS, NPHP1-4-8 et NPHP5-CEP290. D'autres protéines sont également situées à la ZT telles que CBY et AZI1 mais leur interaction avec ces trois modules reste encore peu connue. Chez l'Homme, des mutations de gènes codant des protéines de la ZT sont associées à des maladies génétiques rares, les ciliopathies. Deux modes d'assemblage des cils ont été décrits : la ciliogenèse compartimentée et la ciliogenèse cytosolique. Alors que la fonction de la ZT au cours de la ciliogenèse compartimentée a été bien étudiée, son rôle dans la ciliogenèse cytosolique reste peu connu. La Drosophile possède deux sortes de cellules ciliées, les neurones sensoriels et les flagelles de spermatozoides dont les cils s'assemblent selon ces deux modes d'assemblage. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé ce modèle pour analyser la fonction des protéines de la ZT dans ces deux types cellulaires. Mes résultats montrent que les protéines MKS ne jouent pas un rôle essentiel dans l'assemblage de la ZT dans ces deux types cellulaires. J'ai aussi révélé que CBY et AZI1, coopèrent pour assembler la ZT et qu'elle est nécessaire à l'ancrage du corps basal à la membrane plasmique. De plus, mes travaux ont démontré que KLP59D, une kinésine dépolymérisante des microtubules, est indispensable à la régulation de l'élongation de l'axonème au cours de la ciliogenèse cytosolique. En conclusion, ce travail apporte de nouvelles connaissances sur la dynamique d'assemblage de la ZT des cils et sur les mécanismes qui contrôlent l'élongation de l'axonème.